Ontwikkeling van een RT-PCR voor snelle detectie van enterococcen

Voor snelle bepaling van de hygiënische betrouwbaarheid van drinkwater is, naast de beschikbare RT-PCR methode voor detectie van E. coli, ook een methode voor detectie van enterococcen van groot belang. Binnen het geslacht van enterococcen zijn veel verschillende soorten gerangschikt waarvan slechts een deel wordt aangetoond met de reguliere kweekmethode en kan worden gerelateerd aan fecale verontreinigingen. Voor de ontwikkeling van een nieuwe RT-PCR methode voor detectie van enterococcen is er gekozen om met deze methode minimaal tien geselecteerde enterococcen soorten te detecteren (E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. avium, E. gallinarum, E. moraviensis, E. caselliflavus, E. mundtii, E. hirae en E. haemoperoxidus) . De selectie van deze tien soorten is gemaakt op basis van een, door de drinkwaterlaboratoria uitgevoerde, inventarisatie. Deze inventarisatie is uitgevoerd aan de hand van literatuuronderzoek, fecesonderzoek en onderzoek naar de enterococcen soorten die met de reguliere kweekmethode regelmatig zijn aangetroffen in Nederlands en Belgisch drinkwater. De tien geselecteerde enterococcen soorten zijn, op basis van sequentieovereenkomst van het 16S rRNA gen, te verdelen in vier genetisch verwante groepen. Voor detectie van deze vier groepen zijn meerdere potentieel toepasbare primersets ontworpen, de reactieomstandigheden zijn geoptimaliseerd en de gevoeligheid en specificiteit is, op beperkte schaal, getest. De resultaten van deze analyses zijn gebruikt voor het selecteren van vier veelbelovende primersets. RT-PCR analyses op verdunningen van bekende enterococcen soorten laat zien dat detectie van de tien geselecteerde soorten met voldoende gevoeligheid in potentie mogelijk is. Het gebruik van de ontwikkelde RT-PCR methoden op het RNA van bacteriën die niet behoren tot het enterococcen geslacht en bacteriën die wel behoren tot de tien geselecteerde enterococcen soorten geeft een eerste aanwijzing dat de methoden voldoende specifiek zijn. In tien drinkwatermonsters, afkomstig van verschillende locaties, waarin met kweek geen enterococcen zijn aangetoond werden ook met RT-PCR geen enterococcen aangetoond. Deze resultaten geven een eerste indicatie dat deze nieuwe methoden gebruikt kunnen worden voor gevoelige en specifieke detectie van enterococcen in drinkwater. Om vast te stellen in hoeverre de resultaten met RT-PCR gelijkwaardig zijn aan resultaten verkregen met de kweekmethode zal een uitgebreide validatie volgens ISO 16140-2:2016 noodzakelijk zijn.
Voordat gestart wordt met dit validatietraject is het van belang om onderzoek te doen naar de mogelijkheden voor het combineren van de primersets zodat detectie van de tien soorten in één reactie mogelijk is (“multiplex RT- PCR”). Deze multiplex RT-PCR maakt validatie en toepassing van de methode eenvoudiger en tegen lagere kosten mogelijk. Daarnaast is het, t.b.v. de bepaling van de “Relative Limit Of Detection (RLOD)” van belang om de beschikking te hebben over nauwkeurig gekwantificeerde celsuspensies van enterococcen. Voor het samenstellen van deze celsuspensies is de ontwikkeling van een robuuste methode noodzakelijk.